세포배양과 이식을 이용한 심혈관 질환의 연구와 치료

충북의대  황 경 국

1. 재생의학- 그 새로운 시도

질병은 특정 장기의 손상에 따른 기능소실로 정의될 수 있다. 최근 이러한 기능소실을 극복하기 위한 치료의 한 방법으로서, “줄기세포를 이용하여 소실된 장기를 재생하고자 하는 움직임”이 심혈관계 질환을 중심으로 매우 활발하게 진행되고 있으며, 동물실험 뿐 아니라 임상적 시도에서도 일부 가시적인 성과를 보고하고 있다. (TACT study, TOPCARE-AMI, MAGIC-cell, BOOST trial 등).

일부 긍정적인 성과에도 불구하고, 1) 어떤 환자를 대상으로 할 것인지, 2) 어떤 종류의 세포를 사용할 것인지, 3) 어느 정도의 양과 농도를 어떤 방법으로 사용할 것인지, 4) 이식된 세포의 운명이 장기적으로 어떻게 될 것인지 등 아직도 많은 부분에서 해결되어할 문제들이 있지만, 새로운 치료법의 가능성을 제시하고 있어서 임상의로서 이에 대한 포괄적인 이해가 요구되고 있다.

여기에서는 현실적으로 임상적용의 가능성이 가장 큰 성체 줄기세포(adult stem cell)의 치료 적용에 대해 주로 이야기 하고자 한다.

More Question than Answer

Which patient should be considered for cell therapy ?

Which type of (stem) cell should be used ?

Which quantity and concentration should be used ?

By what mechanism do stem cells engraft, survive, differentiate ?

? Functional improvement : active (ie, by increasing contractility)

passive (ie, by limiting infarction and remodeling)

? Life span of transplanted stem cell

? Safe

? Potential tumorigenesis

? Potential benefit in non-ischemic heart failure

2. 줄기세포의 정의 및 특성

(1) 줄기세포의 정의

줄기세포란 기본적으로 자기복제(self-renewing cell division)가 가능하고, 다양한 세포로 분화(differentiation)될 수 있는 세포로 정의된다. "자기 복제“란 생명체의 거의 전 수명을 통해 장기간 자신과 똑같은 세포를 만들 수 있는 능력을 의미하는데, 이러한 점은 좀 더 분화가 진행된 형태인 ”전구세포"(precursor or progenitor cell)와 중요한 차이점이다. 전구세포는 분화가 진행된 다양한 종류의 세포를 만들어 내지만, 자기 자신과 같은 세포를 복제해 내지는 않는다. 대부분의 경우 줄기세포는 부분적으로 분화된 전구세포의 단계를 거쳐 최종적인 성숙세포로 분화한다. 그러나 일부에서는 줄기세포와 전구세포가 혼용되어 사용되고 있다.

(2) 줄기세포의 채취

줄기세포는 크게 그 기원에 따라 2가지로 분류된다. 태생기의 배아상태에서 기원하여 인체를 구성하는 모든 세포를 만드는 배아 줄기세포(embryonic stem cell)와 그 후 완성된 개체에서 평생 동안 소량으로 존재하면서 손상된 세포를 치환하는 역할을 하는 “성체 줄기세포(adult stem cell)"이다.

배아 줄기세포는 배반포기 배아의 내측세포층(inner cell mass of blastocyst)에서 기원된 pleuripotent stem cell이다. 쥐와 사람에서는 유산된 태아의 gonad로부터 primodial germ cell을 얻을 수 있는데, 이 세포도 배아 줄기세포와 거의 유사하다.

성체 줄기세포는 발생이 완성된 개체에서 온 몸에 퍼져 소량 존재하는데, 정확한 기원은 아직 밝혀져 있지 않다. 골수에 존재하는 조혈모세포(hematopoeitic stem cell), 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell) 등은 분만 후 제대혈에서도 거의 비슷하게 분포하며, 말초혈액에서도 소량 존재한다.

(3) 줄기세포의 특성

노화를 거치지 않으면서 자기복제를 하는 기전, 생체 내․외에서 다양한 세포로의 분화 능력으로 임상 적용의 잠재력이 있는 배아 줄기세포와 성체 줄기세포에 대한 최근 내용들은 다음과 같다.

[1] Telomere의 구조와 기능, 신호전달체계

노화를 거치지 않으면서 자기 복제를 하는 기전은 정상과 조혈모세포(hematopoeitic stem cell)에서의 조혈 telomerase의 구조와 기능, 신호전달체계에서 그 역할에서 알 수 있다.

① Telomere: Telomere는 특정 DNA의 반복과 이와 연관된 단백질로 구성되며, 염색체의 융합(fusion)과 불안정성을 방지하는 역할을 한다. 증식을 하거나, 산화에 의한 DNA 손상 등 기타 다른 원인으로 점차 소실되게 되는데, 이러한 telomere는 역전사효소(reverse transcriptase enzyme telomerase)에 의해 길어짐으로써, 그 소실을 극복한다. 대부분 조혈세포의 경우, telomerase는 엄격히 조절되고 있으며 그 양이 제한되어 있다. 결과적으로 나이가 들면서 점차 짧아지며, telomere가 점차 짧아지게 되면, telomere의 기능이상 및 세포고사뿐만이 아니라, MDS, CML 등 조혈질환과 관련된 염색체의 불안정을 유발할 수 있다.

② Telomere 구조와 기능: 모든 척추동물의 telomere는 TTAGGG/CCCTAA의 tandem repeat와 이 와 연관된 단백질로 구성되어 있다. tandem repeat의 길이는 종과 염색체에 따라 다양하며, 인체의 경우 조직, 연령, 재생능력에 따라 2-15 Kbp정도이다.

③ Telomere와 노화: 대부분의 정상 인체세포는 끝없이 증식하지 않고, 제한된 증식만을 할 수 있도록 program되어 있다. 최근 연구들에 따르면, 증식이 진행되면 점차 telomere의 소실이 나타나면서, 이에 따른 길이 단축이 관찰되고, telomere의 역전사효소에 대한 유전자이식은 telomere의 단축을 방지하고, 세포의 불멸화를 유발시킬 수 있다. 지금까지의 consensus는 telomere의 단축은 무제한적인 증식을 조절하는 checkpoint의 역할을 하는 것으로 여겨지고 있다.

④ Check point and Genom integrity: DNA는 정상 대사산물 뿐 아니라, 환경에 의해 지속적인 공격을 받고 있고, 다음 세대로의 정확한 유전정보 복제, 전달을 위해서는 일종의 감시체제를 유지하고 있다. 이를 "cell-cycle checkpoint"라 한다. 이의 기능은 손상된 혹은 비정상적인 DNA를 발견하고, 이를 복구하여 세포주기의 정상적인 진행을 조절하는 것이다. 최근 인간과 같이 장수하는 생물은 오래 살지 못하는 생물에 비해 게놈의 통합성유지를 위한 감시체제를 추가적으로 가지고 있음이 밝혀지고 있는데, telomere의 길이와 기능과 관련된 checkpoint도 있다.

Telomeric DNA소실: telomeric DNA는 DNA의 증식, 재형성, 복구와 관련되어 점차 소실된다. 이의 원인은 “end-replication problem”에 의한 것으로 알려져 있다. 최근 telomeric DNA의 G-rich repeat는 다른 부위보다 5-10배 이상 산화손상에 민감한 것으로 알려져 있다.

Telomere 신호전달체계: 단축된 짧은 telomere가 DNA 손상을 신호화하는 것에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 최근 telomere의 동적인 구조에 대해 많은 연구가 이루어지고 있는데, 각각의 telomere가 손상된 DNA의 downstream pathway를 on 혹은 off로 신호화될 수 있을 것으로 보인다. 3‘ 말단이 이러한 신호화에 관련된 것으로 추측된다.

telomere는 정상세포의 분열 수를 조절하는 중요한 조절요소로서 telomere checkpoint의 활성화는 증식과 함께 telomeric DNA의 소실과 산화손상을 유발한다. telomere checkpoint에 의해서 유발된 DNA 손상반응은 telomerase 혹은 recombination을 통해 telomere가 길어짐으로써 해결될 수 있다. 그러나, 줄기세포를 포함한 대부분의 체세포는 telomere repair능력에 한계가 있으며, 따라서 telomere의 길이단축은 세포증식을 효과적으로 억제하고 있다.

Stem cell 혹은 다른 증식성 질환의 “exhaustion”이라는 잘 이해되지 않는 현상을 설명하는 한 방법으로 telomere checkpoint의 기능이 제시되고 있다.

Telomere check point

continue proliferation

replicative loss of telomeric DNA          hTERT, hTR

telomerase

telomere check point            P53                               telomere elongation

or failed repair

Oxidative change                           recombination

Apoptosis, Replicative senescence

[2] 배아 줄기세포

줄기세포는 많은 조직에 존재하며, 매우 일부를 제외하고는 제한된 lineage의 분화된 세포를 형성한다. 이와는 대조적으로 배아에서 유래된 배아 줄기세포는 성체 줄기세포에 비해 더 다재다능하다.

배아와 pleuripotent 줄기세포

수정은 동시에 세포분열을 촉진한다. 인체의 경우는 4-8 세포기에서 배아의 게놈이 활성화된다. 배반포기의 inner cell mass는 인체를 이루는 모든 조직을 만들 수 있고. 여기에서 줄기세포를 분리할 수 있다. 배반포를 형성한 이후 inner cell mass는 totipotent하지는 못하고, pluripotent하다. 원시적인 endoderm인 yolk sac은 pleuripotent한 줄기세포의 영양분을 공급할 뿐만이 아니라, diactate cell의 운명을 결정하는 데 중심역할을 하며, germ cell은 이 시기까지는 pleuripotency를 가지고 있다.

배아의 pleuripotentiality에 대한 분자생물학적 조절에 대해서는 아직 잘 알려져 있지 않고, 전사인자인 Oct-4, FoxD3, 새로운 유전자인 taube nuuss 등이 관련이 있는 것으로 알려져 있다.

배아 줄기세포의 유래와 기능

배아 줄기세포는 배반포기의 inner cell mass에서 기원한다. 착상 전후의 포유동물 배아의 경우, pleuripotent한 줄기세포는 오래 지속되지 않지만, 생체 외(in vitro)에서는 불멸화된다.

Pleuripotent 줄기세포의 특징

배아 줄기세포는 저절로 3 germ layer의 다양한 세포들로 분화가 될 수 있다. pleruipotent의 중요한 정의 중 하나는 1개의 단일세포로부터 stem cell line이 clone될 수 있다는 것이다. 배아 줄기세포는 적당한 조건하에서 불멸화된다. 따라서 배아줄기세포는 무제한적으로 원시적인 uncommitted state를 유지하며, 한 개체를 이루는 모든 조직으로 분화가 된다.

쥐와 영장류의 pleuripotent 줄기세포에서 공통적으로 흔하게 나타나는 것은 alkaline phosphatase의 일부 형, 성장인자인 GDF-3, teratocarcinoma-derived factor-1, Oct-4, FoxD3 등이다.

배아 줄기세포의 성장과 분화

쥐의 배아줄기세포, 배아 성선세포, 인간의 배아줄기세포를 포함한 영장류의 pleuripotent 줄기세포는 쥐의 배아 섬유아세포 feeder-cell layer가 필요하다. 이 feeder cell들의 표현형은 정확히 알려져 있지는 않지만 성인의 섬유아세포와는 다른 것으로 알려져 있다. 쥐의 배아줄기세포, 배아 성선세포는 LIF 혹은 이 계통의 cytokine에 영향을 받으며, 인간의 배아줄기세포는 영향을 받지 않는다.

배아 줄기세포의 생체내 분화는 윤리적인 문제와 관련되어 있어서, 인간의 배아 줄기세포가 신생아의 모든 장기 조직을 형성할 수 있음을 인간실험으로 증명하는 것은 불가능하다. 그러나, immunodeficiency animal을 통한 실험에서는 이를 쉽게 증명할 수 있다. 믿을 수 없을 정도로 다양하게 분화된 양성 teratoma를 형성할 수 있으며, 또한 ganglia와 같이 잘 짜여진 복잡한 조직으로의 분화도 나타나며, 이러한 양성 teratoma에서는 배아처럼 axis형성 혹은 분절 형성과 같이 추후 예정된 body plan을 보이지는 않는다.

생체외 분화를 유도하는 가장 흔하게 방법은 EB(embryonic body) 형성이다. 이들은 항상 배아 줄기세포배양(suspension culture or fibroblast feeder cell layer)에 있어서 중간에 위치하며, outer cell layer는 extra-embryonic endoderm으로, inner cell layer는 pleuripotent tissue로 나타난다.

[3] 성체줄기세포

성체줄기세포는 발생이 완성된 개체에서 온 몸에 퍼져 소량 존재하는데, 정확한 기원은 아직 밝혀져 있지 않다. 골수에 존재하는 조혈모세포(hematopoeitic stem cell), 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell) 등은 분만 후 제대혈에서도 거의 비슷하게 분포하며, 말초혈액에서도 소량 존재한다. 대표적인 예가 조혈모세포이다. 1개의 조혈모세포는 모든 혈구세포로 분화되며, 일부는 자기와 같은 세포로의 자기복제를 하는 비대칭적인 증식한다. 조혈모세포 경우 CD34(+), c-kit(+), Thy 1(+) marker를 가지며, 성체 줄기세포는 배아 줄기세포와는 달리 자기복제능력이 떨어지고, telomerase level이 상대적으로 낮다.

성체 줄기세포는 자기 복제 및 분화의 연구에 강력한 도구로 이용될 수 있다. 특히 가소성(plasticity)이라는 특성은 줄기세포에 영향을 주는 성장인자, 세포 외 신호전달에 관한 연구의 필요성을 가져왔다. 또한 탈분화 및 재분화 과정이 제시됨으로써, 이 부분에 대한 유전적 정보수준에의 연구의 필요성도 대두되었다. 출생 후 성인에서도 원시적인 pleuripotent 줄기세포가 존재함이 제시되고 있다 (MAPS: multipotent adult stem cell).

성체줄기세포- Plasticity (가소성)

“Plasticity"는 새롭게 밝혀지고 있는 줄기세포의 특성 중 하나로, 한 개의 성체조직에 존재하는 줄기 세포가 다른 조직의 세포로 분화하는 현상으로, ‘trans-differentiation’ 혹은 ‘unorthodox differentiation’이라고도 한다. 예를 들면 조혈모세포가 신경세포 혹은 간세포, 근육세포 등으로 분화되는 것으로 중배엽 줄기세포에서 외배엽, 내배엽 세포를 만들어 내는 현상(developmental plasticity) 또는 같은 중배엽내에서도 다른 세포로 만들어 내는 현상(geographic plasticity)이다.

대부분 가소성을 증명한 연구가 골수에서 유래된 세포(BM-derived cell)로 시행되었으며, 실제로 여기에는 여러 종류(HSC, Mesenchymal cell, endothelial progenitor cell)가 혼재되어 있다. 골수이식을 시행받은 환자에서 공여자에서 유래된 조혈 linage가 아닌 mesodermal lineage세포를 증명되었고, 골격근, 내피세포, 심근세포 등도 확인이 되었다.

아직 다음과 같은 이유로 비판의 여지가 있다. ① 대부분 연구들이 보다 완전한 확인이 필요하며. ② 다른 linage로의 변화가 되는 빈도가 낮다. ③ 대부분의 연구가 1개의 세포에서 2개 이상의 lineage로의 기능적 분화에 대한 증명이 부족하고. ④ 대부분 이러한 lineage-swith는 이전에 확립된 발생학 및 줄기세포학에 도전을 하고 있다는 점 등이다.

가소성-가능한 기전

① 여러 종류의 조직-특이 줄기세포가 서로 다른 장기에도 존재한다.

② 융합의 가능성 (fusion): 이미 존재하는 세포와 새로 주입된 줄기세포의 융합(4n: 2n+2n)

③ 세포의 탈분화 및 재분화 과정

④ 진성 pleuripotent 혹은 multipotent 줄기세포가 출생 후에도 지속적으로 존재한다.

Fig 1.  Schematic representation of the process of differentiation of adult stem cells in cell lineages of the organ of origin, of the process of transdifferentiation of adult stem cells in cell lineages different from the organ of origin, and of the process of fusion of adult stem cells with terminally differentiated cells. The mermaid, half-woman and half-fish, is used as a symbol of cell fusion; Daphne, who transforms herself into a tree, is used as a symbol of cell transdifferentiation.  (Anversa et al Circulation 2004:109:2832-2838)

3. 줄기세포를 이용한 치료 적용의 현재: 성체 줄기세포를 이용한 혈관 재생과 심근 재생.

현재 줄기세포를 이용한 세포치료는 성체 줄기세포를 이용한 새로운 “혈관 형성”과 “심근 재생”에 촛점을 두고 있다. 최근 임상 시험이 빠르게 시도되고 있으며, 일부에서는 이미 효과가 증명이 되고 있다. 2002년 일본의 Murohara그룹이 최초로 만성 허혈성 하지질환 환자에서 골수 유래 단핵구(BM-derived MNC)의 국소주입이 효과가 있음을 보고하였고(TACT study), 이후 독일의 Dimmeler 그룹이 급성 심근경색 환자에서 골수유래 단핵구 및 혈관내피-전구세포(EPC: endothelial progenitor cells)의 관상동맥내 직접 주입이 임상적으로 효과가 있음을 발표하였다.(TOPCARE-AMI, BOOST trial (2004))

이를 근간으로 국내 서울대병원의 박영배/김효수 그룹에서 급성 심근경색 환자에서 G-CSF를 이용한 골수내의 multipotent cell 혹은 progenitors의 동원(mobilization)효과에 대해 보고하였고(MAGIC-cell study), 미국내에서도 다기관 임상연구가 진행되고 있다.(Human study : Cindy L Grines. Royal oak)

이러한 괄목할 만한 결과에 대해서도, 이들의 장기적인 임상효과 및 그 임상적 효과가 새로운 혈관의 형성인지, 심근의 형성인지 혹은 2부분이 다 포함이 되었는지, 2부분이 다 포함되었다면 어느 부분이 주 된 부분인지 등에 대해서는 추가적인 연구의 필요성이 있다.

또한 효율적인 치료를 위해서는 보다 많은 양의 줄기세포 확보, 능력의 개선 및 가능한 한 많이 필요한 부위에 투입(homing)되도록 하여야 하는데, 이를 위해서 여러 측면에서 동시적인 연구가 필요하다.

① 줄기세포 동원 측면의 개선: Enhanced mobilization by VEGF, GM-CSF, G-CSF, SCF, SDF-1, Angiopoetin-1, MMP-9 and pharmacologic agent such as statins.

② 줄기세포 기능향상 측면의 개선: In vivo, ex vivo modification such as improved survival or proliferation (genetic modification). Tissue engineering.

③ 줄기세포 귀환 측면의 개선: Mechanism of homing, enhanced homing

4. 치료적 적용: 혈관 재생과 허혈성 심혈관계 질환

(1) 혈관의 재생

혈관의 재생-치료적 혈관 신생술(therapeutic angiogenesis)은 새로운 혈관의 성장과정과는 다른 과정이다. 새로운 혈관 형성은 vasculogenesis, arteriogenesis, angiogenesis로 구분할 수 있으며, 그 정의는 다음과 같다.

① Vasculogenesis: 태생기 혈관의 발생과정시 관여하는 발생학적 혈관의 생성과정을 일컫는다. 이 과정은 primitive cell로부터 혈관이 형성되는 과정을 일컫는다.

② Arteriogenesis: 기존의 collateral 발달이나, 성숙혈관의 de novo 과정으로 잘 성숙된 중막(media)을 소지하고 있는 혈관의 생성이다.

③ Angiogenesis: 발달된 중막이 결여된 새로운 혈관의 생성과정이며, 상처의 치유나 심근 경색부위의 capillary proliferation 등이 좋은 예이다.

성인에 있어서 혈관의 신생과정은 기존의 혈관으로부터 혈관 내피세포가 증식, 이동, 분화함으로써 자라나오는 과정인 angiogenesis에 의해 주로 일어나는 것으로 알려져 왔다. 즉 활성화된 혈관내피세포가 기저막의 파열부위를 통해 이후 간질로의 이주, 증식 및 분화로만 이해되어 왔었다. 그러나, 성인 말초혈액에서도 혈관내피 전구세포(endothelial progenitor cells) 또는 angioblast에 의한 혈관생성의 과정이 밝혀져 발생학적인 과정인 vasculogenesis가 관여함이 알려졌다. 이러한 과정의 치료적 적용을 “치료적 혈관 신생술 (therapeutic vasculogenesis (angiogenesis))라 한다.

(2) Therapeutic Angiogensis (Vasculogenesis)

줄기세포를 이용한 혈관신생요법 개발 분야에서는 현재 성체 줄기세포를 주로 이용하고 있다. 이는 성체 줄기세포가 배아 줄기세포와는 달리 윤리적 문제 소지가 없으며, 환자 자신의 몸에서 추출하여 다시 주입하는 자가이식이 가능하다는 점, 어느 정도 특정 세포형으로 분화가 약속된 상태의 세포를 이용함으로써 특정 장기를 재생시키는 목적으로 사용하기에 유리하고, 특정한 방향으로 분화를 유도하는 법을 찾아야 하는 전제조건이 상대적으로 필요 없다는 등의 장점이 있다.

[1] 혈관내피 전구세포(endotherial progenitor cell : EPC, Fig 2)

1997년 Asahara 등이 말초혈액 내에서 CD34(+) 세포를 분리하여 배양한 결과 이들이 혈관내피세포로 분화하며 생체 내에서 혈관형성에 참여한다는 사실을 발표하면서 혈관내피-전구세포(EPC)가 처음으로 알려지게 되었다. 발생, 분화 측면에서는 Hematopoietic stem cell(HSC)과 가까우며, FIK-1(KDR) tie-2, CD34, Scal, c-kit 등의 marker가 EPC와 HSC에서 공통적으로 발현된다. 이 2세포는 서로 각자의 방향으로 분화하면서 차이가 나게 되는데, 내피세포로 가면서 내피세포 특이항원 (VE-cadherin, vWF)이 나타나며, HSC가 혈액세포로 분화하게 되면 CD34, FIK-1, VE-cadherin, vWF도 없어지게 된다.

Asahara의 보고 이후 심혈관계분야에서 EPC에 대해 많은 연구가 이루어지고 있으며, 최근 그 origin, 분화과정에 대해서 일부 알려지고 있다. EPC의 기원에 대해 Multipotent Adult Progenitor Cell(MAPS)에 대한 보고가 있다. 인체의 골수에서 MNC을 분리한 후 CD45(+)cell (Leukocyte Common Antigen)과 glycophorin A(+) cell(RBC)을 제거한 다음, DMEM에 VEGF를 투여한 후 계속 배양한 결과, endothelial cell을 얻을 수 있었고, 각 배양일마다 marker study를 시행한 결과 KDR(+), AC133(+), CD34(-) cell: Multipotent Adult Progenitot Cell 이 그 기원임을 보고하였다.

EPC의 임상적 효용성에 대해서는 인정되고 있으나, 각 연구자들에 따라 다른 marker에 대한 연구가 되어지고 있고, 아직도 그 정의에 대해서 명확히 확립된 것은 아니다.

EPC는 말초혈액, 제대혈, 골수 유래 단핵구, CD34(+) 혹은 AC133(+) 세포에서 분리 추출할 수 있다.

말초혈액은 간편하게 채취할 수 있고 자가이식이 가능하지만, 단핵구 중에서 혈관내피-전구세포의 비율이 0.2%정도로 충분한 수의 세포를 확보하기가 어렵다는 단점이 있다. 이러한 한계점의 극복을 위해서는 혈관내피-전구세포의 동원의 증진 및 이들의 대한 기능 향상을 위한 체외 modification이 중요하게 부각되고 있다. 골수는 채취하는데 환자에게 고통을 주기 때문에 어려운 점이 있으나, 단핵구 중에서 혈관내피- 전구세포의 비율이 3%에 달하기 때문에 효율이 좋은 장점이 있다. 제대혈은 상기 2 가지 채취원과는 달리 자가이식이 불가능하기 때문에 당장 임상적으로 적용하기는 어렵지만, 최근 출생 시 제대혈을 냉동 보관하는 경향이 일어나고 있기 때문에 추후 적용 가능성이 있다. 성인의 골수세포보다 자가분열능력이 뛰어나고, 세포분열이 빠르며 tolerance가 상대적으로 길어서 여러 면에서 우수한 줄기세포를 제공하는 근원이 된다. 혈관내피-전구세포의 비율도 단핵구의 2%를 차지하는 것으로 알려져 있다.

[2] 효율적인 혈관내피-전구세포 치료 적용을 위한 방안 (Fig 3)

전술한 바와 같이 효율적인 치료를 위해서는 줄기세포의 동원 증강, 기능향상, 귀환의 증강 측면의 개선을 위한 기전에 대한 동시적인 연구가 필요하다.

(3) Enhanced Arteriogeneis

전구세포 혹은 줄기세포에 의한 측부 혈관의 발생기전 (Kinnaird et al, Fig 4)

혈관내피-전구세포 혹은 줄기세포에 의한 측부 혈관 형성, 발달에 관여할 가능성도 제기되고 있다.

① 간접적, 보조적 역할: 줄기세포로부터 다양한 사이토카인, 성장인자, 키모카인 등의 분비.

Progenitor cells secrete multiple cytokines, growth factors, and chemokines that could facilitate arteriogenesis by (a) influencing the matrix in a way that would be conducive for collateral development, (b) inhibit endothelial and smooth muscle cell apoptosis and stimulate their migration and proliferation, and (c) recruit pro-arteriogenic inflammatory and progenitor cells.

② 직접적 역할: 직접 측부 혈관에 Incorporation

Progenitor cells could directly incorporate into the developing collateral and thereby physically contribute to collateral formation; the biological importance of this mechanism is presently a source of controversy.

③ 기타 제시된 가능한 역할: Fusion

Fusion of progenitor cells with tissue specific cells has been demonstrated, but no data are available suggesting this functionally contributes to collaterogenesis.

Fig  2.    Origin and differentiation of EPC. (Urbich and Dimmeler et al, Circ Res. 2004;95:343-353.)

Fig      3.    Mechanism of EPC homing & differentiation. Recruitment and incorporation of EPCs into ischemic tissue requires a coordinated multistep process including mobilization, chemoattraction, adhesion, transmigration, migration, tissue invasion, and in situ differentiation. (Urbich and Dimmeler et al, Circ Res. 2004;95:343-353.)

Fig 4. Mechanisms by which progenitor cells could enhance collateral development. (Kinnaird et al Cir Res 2004;95:354-356)

Hematopoetic Stem cell                             Endothelial progenitor cells

CD31(+),CD34(+),c-kit(+)                          CD34(+),AC133(+),KDR(+),Tie-2(+)

Monocyte lineage                                     Endothelial cell

CD14(+),CD45(+),Mac-1(+)                           CD133(-),vWF(+),CD31(+),KDR(+)

Arteriogenesis and Angiogensis

Mesenchymal stem cell   BM-derived Mononuclear cell   Filtered freshly apirated BM cells

CD34(+),CD45(-),c-kt(-)

Fig 5. Diffrent subpopulations of progenitor cells that have been found to enhance collateral development (Kinnaird et al Cir Res 2004;95:354-356)

(4) 허혈성 하지 혈관 질환 및 허혈성 심질환에서의 임상 시험 성적 및 결과 (table1-3)

2002년 Tateish-Yuyama, Murohara 등은 허혈성 하지 말초혈관 질환자 자신의 BM-MNC을 이용, 허혈하지에의 이식치료가 안정성을 확보하고 있으며, 임상증상 (ankle-brachial index, rest pain, pain-free walking time, transcutaneous oxygen pressure)도 호전을 시킴을 최초로 보고하였다. (Therapeutic Angiogensis using Cell Transplantation. TACT study). 여기에서는 BM-MNC의 이식과는 달리 말초혈액의 monocyte는 효과가 없음도 보고 되었다. 이들은 그 효과가 BM-MNC이 EPC를 제공하며, 다양한 angiogenic factor, cytokine을 분비하여 혈관형성을 촉진하기 때문으로 설명하였다.

자신의 BM-MNC를 이용함으로써, 윤리적 문제의 소지없이 세포이식치료의 (단기적) 안정성과 효율성이 허혈성 하지 혈관질환에서 보고 된 이후 허혈성 심질환에서도 임상 시험이 이루어졌다.

먼저 급성 심근경색 환자에서의 관동맥내 BM-MNC 직접 주입의 효과가 보고되었다. (Table 1. Strauer et al). 이후 같은 Dimmeler 그룹에서 심근경색 발생 평균 4.3±1.5일 후 재관류가 시행된 급성 심근경색 환자 20명을 대상으로 BM-MNC(9명), CPC(blood -derived progeniotr cells, EPC)(11명)에게 세포치료를 시행하였고, 4개월 뒤 추적한 결과 생존심근의 증가, 심기능의 호전이 유의하게 나타났으며, 염증반응 혹은 부정맥 등 부작용이 없음을 보고하였다.(TOPCARE-AMI). 이러한 사실은 관동맥내 BM-MNC의 직접 주입이 이론적으로 나타날 수 있는 no-reflow (plugging by MNC or WBC aggregation)와 같은 특이 부작용 없이 안전함을 보여준 결과이었다.

최근 Wollert 등은 관동맥내 BM-MNC의 전향적, 무작위 임상시험의 6개월 결과를 보고하였다. ST상승 급성 심근경색 환자 60명을 대상으로 중재시술과 이후 적절한 약물치료를 한 대조군(30명)과 중재시술 후 약물치료와 같이 평균 4.8일 후 BM-MNC를 주입한 세포치료군(30명)을 6개월 후 심장기능의 호전을 MRI로 비교한 결과 대조군의 좌심실 구혈율 증가(0.7%)보다 세포치료군에서 유의하게 증가(6.7%)함을 보고하였다(BOOST trial).

현재까지의 임상 결과들은 그 수가 적고, 단기적 추적관찰, 안정성과 feasibility를 확인하기 위한 임상시험으로 제한점은 있지만, 적어도 세포치료가 단기적인 임상적 호전과 함께 안전성을 확보하고 있다고 여겨진다.

보다 현실적으로 쉽게 사용되기 위해서는 골수에서 직접 BM-MNC를 채취하여 직접 관동맥내로 주입하지 않더라도 같은 세포치료 효과를 낼 수 있는 방법 (예컨데, 동원촉진인자로 충분한 전구/줄기세포를 말초혈액내로 동원시키는 방법)의 개발이 요구되고 있다. 이러한 관점에서의 임상 시험이 국내 서울대병원에서 시도되어 일부 결과가 보고 되었다. (MAGIC-cell study). BM-MNC의 채취 및 관동맥내 직접 주입이 아니라, 동원인자인 G-CSF를 통해 동원된 말초혈액 MNC (PB-MNC)을 중재시술 직후 관동맥내 직접 주입한 세포치료 군(10명)과 동원인자인 G-CSF만 투입하고 중재시술을 시행한 군(10명), 중재시술만 시행한 군(7명)을 비교한 결과, 6개월 후 G-CSF를 사용한 세포치료 군과 동원 군 모두에서 심근 기능호전이 나타났으며, 동시에 예측과는 달리 경색관련 혈관 재협착의 증가도 같이 관찰되었다.

급성 허혈성 질환뿐만이 아니라 만성 허혈성 심질환에서도 그 효과가 일부 보고되고 있다. CABG 도중 AC133(+) 세포를 직접 심근에 주입하거나(Stamm et al), NOGA 카테터를 이용한 electromechanical mapping guide하에 심실강내에서 직접 심근으로 주입하는 방법(Perin et al, Tse et al, Fuchs et al)을 통하여 일부 효과를 보고하고 있다.(Table 2)

Table1. Stem/Progenitor Cell Therapy (Intracoronary Application) in Patients With AMI.

Reference	Cell Type	Patients	Effect
Strauer	BMC (40 ml) vs Control	n=10 n=40*	Hypokinesia↓(LVA) Cotractility infarct region↑ End-systolic volume↓ Perfusion↑(thalium scintigraphy)
TOPCARE-AMI	BMC (50ml) vs CPC (250ml) vs Control	n=20 n=59	Global, regional EF↑ ( LVA, echoCG, MRI ) End-systolic volume↓ Viability ↑(PET, MRI) Coronary flow reserve↑
BOOST	BMC (120ml) vs Control (prospective randomized)	n=30	EF↑(MRI)

TOPCARE-AMI indicates Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction; BMC, bone marrow cell; CPC, circulating progenitor cell; LVA, left ventricular angiogram; BOOST, BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration; and EF, ejection fraction.

Table2. Stem/Progenitor Cell Therapy in Patients With Chronic Ischemic Heart failure.

Reference	Cell type	Application	Patients	Effect
Surgical application Stamm et al	CD133(+) BMC (85-195ml)	Injection during CABG	n= 6	Feasible EF↑in 4 pts (LVA) Perfusion↑in 5 pts (SPECT)
Percut. application Tse et al Fuchs et al Perin et al	BMC (50ml) BMC BMC (50ml)	Intramyocardial/NOGA Intramyocardial/NOGA Intramyocardial/NOGA vs control	n= 6 n=10 n=14	Feasible Wall motion & thickening↑ Feasible, Angina score and stress-induced ischemia↑ EF↑:end-systolic volume↓

Table 3. Preclinical and clinical cell-based Therapy for therapeutic aniogensis of ischemic myocardium (Melo et al Cir 2004;109:2386-2393)

5. 치료적 적용: 심근 재생과 허혈성 심혈관 질환

(1) 심근 재생

“심근의 재생은 가능한 가?”, “재생된 심근이 통합된 심장 기능에 역기능 없이 기능향상을 가져 올 수 있는가 ?”. 이러한 2가지의 직접적인 물음에 대해 동물실험 및 일부 인체실험에서 조직검사로 확인된 긍정적인 보고들이 있다. 여러 동물실험에서 사용된 세포들 즉, BM-MNC, BM-derived mesenchymal stem cell, skeletal myoblast 등이 심근세포의 표현형을 지니는 세포로 분화한다는 보고들이 있다. 심근의 표현형을 가지며, 일부에서 기능적으로 주위 정상 심근세포와의 연결을 가지고 있고, 심기능의 향상을 가지고 왔다는 부분에서 심근재생 세포치료의 가능성을 보여준다.(table 4)

그러나, 이러한 심기능의 향상이 주입된 이식세포가 host cariomyocyte와 직접 기능적으로 통합하여 나타나는 효과인지, 혈관의 형성 혹은 경색 후 재형성 호전과 같은 간접적 작용인지에 대해서는 아직 잘 알려져 있지 않다.

Rubart 등은 MHC-EGEP trangenic mice에 fetal cariomyocyte를 이식한 결과 host cariomyocyte와 직접 기능적인 통합을 보임을 보고하였고(Rubart Cir res 2003;92-:1217-1224), He 등은 인간 배아 줄기세포가 다양한 type의 태아 심근세포로 직접 분화됨을 보여주어 이식세포의 직접적 효과에 대한 가능성을 보여주었다.(He et al, Cir res 2003;93:32-29)

(2) 임상적용 현황

골격근 근육모세포는 정상 골격근 근육의 기저막하에 존재하는데, 1) 자가 이식이 가능하고, 2) 세포외 배양에서 쉽게 증폭할 수 있으며, 3) 근육세포로의 분화가 쉽고, 4) 허혈에 대한 저항성이 강하다는 점 등 임상적 유용성이 높다. (Table 5).

2001년 Menarche 등은 환자의 심근 경색부위에 환자 자신의 골격근 근육모세포를 주입한 후 5개월 후 평가한 결과 이식된 세포가 심근 경색부위에 살아 있으며, 동시에 심장 수축 기능이 향상됨을 보고하였고(Menarche P et al 2001), 2003년 근육모세포를 이식한 환자가 임상적 호전으로 유지되다가 17.5개월 뒤 사망한 부검예의 조직소견에서 심근 경색부위에 이식된 근육모세포가 수축기능을 유지하면서, skeletal myotube가 잘 발달되어 있음을 보고하였다. Myotube의 65%에서는 slow myosin form을, 33%에서는 slow와 fast isoform을 동시에 가지고 있었는데, 이러한 분포는 정상 골격근에서의 분포(44% 및 0.6%)와 차이를 보이고 있었다. 즉 정상 골격근의 경우 fast (55%) 혹은 slow isoform (44%)을 따로 가지고 있는 경우가 대부분이며, 같이 표현되는 경우는 0.6%로 아주 드물어, 위 사실은 주위 심장조직에 의한 반복적인 수축에 의해 slow isoform의 새로운 발현의 증가를 가져왔음을 시사한다. (Hagege et al 2003). 또한 Pegani 등은 Ventricular asssit device(VAD)와 근육모세포 이식(이식 세포수: 3억)을 시행한 5명의 말기 심부전환자 중 4명의 조직소견을 보고하였는데, 이식근육세포는 심근경색 반흔부위에 mature myofiber를 형성하였고, 생존 myotube 주위에는 소혈관의 증식소견도 같이 관찰됨을 보고하였다. (Pagani et al JACC 2003)

골격근 근육모세포 이외에 BM-MNC의 심근 재생효과도 고려해 볼 수 있다. 즉, TOPCARE-AMI, BOOST 등 관동맥내 BM-MNC의 주입을 통한 심기능 향상의 임상적 효과에서 심근재생의 효과를 고려해 볼 수 있다. 아직 그 임상적 효과가 구체적으로 새로운 혈관의 형성인지, 심근의 형성인지 혹은 2 부분이 다 포함이 되었는지, 2부분이 다 포함되었다면 어느 부분이 주 된 부분인지 등에 대해서는 알려져 있지 않으며, 이에 대해 추가적으로 연구할 필요성이 있다. 이론적으로는 2부분이 모두 포함되어 있을 가능성이 높다고 생각된다.(fig 6).

최근 이와 관련된 1편의 동물 연구가 발표되었다. Agbulut 등은 nude rat의 관동맥 결찰로 심근 경색을 유발한 후 인간의 근육모세포와 골수 유래 CD133(+) 전구세포를 직접 근주하여, 1개월 뒤 이들을 비교하였는데. 두 군 모두 대조군(배양액 근주)에 비해 유의한 심근의 기능호전을 가져왔으나, myotube는 근육모세포 근주군에서만 나타났고, 골수 유래 CD133(+) 전구세포 근주군에서는 PCR에 의해서만 겨우 발견되었다.(Agbulut 2004) 이러한 사실은 TOPCARE-AMI, BOOST 등 관동맥내 BM-MNC의 주입을 통한 심기능 향상의 임상적 효과가 주로 새로운 혈관의 형성에 의한 효과일 가능성을 시사한다 하겠다.

Table 4. Animal Studies of Myocardial Regeneration by Stem Cell (Penn et al 2002).

Study	Animal model	Cell type	Source	Time after infarction	Effect on LV function	Comment
Tomita et al Koocher et al Orlic et al Murry et al Pouzet et al	Rat Rat Mouse Rat Rat	BM cell CD34(+) BM cell c-kit(+) BM cell Skeletal myoblast Skeletal myoblast	Autologous Human Autologous Neonatal Adult	3 weeks 48h 3-5 h immediate 1 week	Improved Improved Improved N/A Improved EF	Improved function only in cell grown in 5-azacytidine to promote cardiomyoctyes Nude rat Cell injected into peri-infarct myocardium Skeletal myoblast contract with stimuli Improvement correlated with injected cell number

Table 5: Advantage & Disadvantages of Potential Clinical Strategies for Preservation or Restoration  of Myocardial Function (Forrester et al Cir 2003;108: 1139-1145)

Decreased infarct expansion

Angiogenesis               Increased collagen expresion

Myocardial Preservation        Stem Cell Therapy      Myocardial Regeneraton

Decreased apoptosis             Myocyte Regeneration

Attenuation or Reversal of Post-infarct Left Ventricle Remodeling

Fig 6. Potential beneficial mechanisms of stem cell therapy after myocardial infarction. Angiogenesis, decreased apoptosis of native cardiomyocytes, and enhanced collagen formation may limit infarct expansion and preserve myocardium. Proliferation of new cardiomyocytes can lead to myocardial regeneration. Together, these elements may diminish or reverse the negative left ventricular remodeling seen after infarction, leading to stabilization of ventricular dimensions and systolic function, with the potential for improved patient symptoms and outcomes. (Forrester et al Cir 2003;108: 1139-1145)

6. 추후 해결해야 할 연구

일부 임상적 성과에도 불구하고 어떤 환자를 대상으로 할 것인지, 어떤 종류의 세포를 사용할 것인지, 어느 정도의 양과 농도를 어떤 방법으로 사용할 것인지, 이식된 세포의 운명이 장기적으로 어떻게 될 것인지 아직도 명확히 해결되어할 여러 문제들이 있다. 또한 줄기세포의 잠재적 능력에도 불구하고, 그 수를 충분히 확보하기에 어려움이 있으며, 심장/허혈하지와 같은 표적장기에 대한 신생혈관/(심근)재생에 참여하는 줄기세포의 비율이 저조하다는 한계점이 있다. 치료적 효과를 높이기 위해서는 보다 많은 양의 줄기세포를 확보하고, 되도록 많이 표적 장기에 투입되도록 하여야 하며, 치료에 이용되는 줄기세포의 기능적 향상(유전적 변형, 조직 공학적 접근) 등 다음의 여러 측면에서 동시적인 연구가 시행되어야 할 것이다.

① 줄기세포의 동원 측면의 개선

: enhanced mobilization. specific or non specific mobilizer

② 줄기세포 기능적 향상 측면의 개선

: in vivo, ex vivo modification such as improved survival or proliferation

: tissue engineered material such as viable graft

③ 줄기세포 귀환 측면의 개선

: mechanism of homing, enhanced homing

이러한 과제들이 해결이 된다면, 현행 중재시술과 같이 치료법의 한 부분으로서 세포이식 치료법이 도입될 수 있을 것으로 사료된다.

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