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| 심장특이적 전사조절인자인 Homeodomain Only Protein, HOP의 결합단백질과 표적유전자 탐색 |
| 전남대학교 의과대학 유전자제어 의과학 연구센터¹ , 전남대학교 병원 순환기내과² , 광주광역시 501-746, Molecular Cardiology Research Center, University of Pennsylvania, Philadelphia, USA³ |
| 박혜영¹, 기해진¹ , 정진영¹ , 엄광현¹ , 정성지¹ , 김용숙² , 안영근² , 정명호² , 백영홍¹ , 김경근¹ , Jonathan A. Epstein³ , 국현¹ |
최근에 발견된 Homeodomain only protein (HOP)는 심장발달단계에서 serum-response factor (SRF)의 전사활성화를 억제하고 (Chen 등, Cell. 110: 713-723, 2002) class I histone deacetylase (HDAC)인 HDAC2와 결합하여 심장비대억제유전자를 억제함으로써 생후 심장비대증을 유발한다 (Kook 등, J Clin Invest 112: 863-872, 2003). 그러나 아직 HOP/HDAC2 복합체가 어떤 표적유전자를 억제시키는지에 대한 연구는 전혀 이루어져 있지 않다. 그러므로 본 연구에서는 동물 또는 근육아세포 등을 이용한 HOP 과발현모델에서의 proteomics기법을 응용한 binding candidate screening법과 yeast two hybrid기법을 이용하여 HOP complex를 이루는 단백질들을 찾고 이 복합체에 의해 조절되는 표적유전자와 관련된 심장특이적 유전자를 발굴하였다. 먼저 동물모델로서 alpha myosin heavy chain promoter를 이용하여 태생 후 심장에서 HOP의 발현이 증가되는 transgenic mice를 제조하여 심장비대증이 일어남을 확인하였고 본 실험에 이용하였다. 또한 HOP과 HDAC2항체를 순차적으로 이용하여 chromatin immunoprecipitation (ChIP)기법을 응용한 promoter유전자 탐색법으로 그 downstream target을 조사하였다. 4주령의 HOP transgenic mice의 심장에서 RNA를 DNA microarray를 실시하였고 real time PCR을 이용하여 확인하였다. 또한 HOP과 결합된 단백질을 직접 동정하기 위해 pGEX2T-HOP construct를 제조하였고 GST-full down을 응용한 결합단백질 탐색을 시도하였으며 인간 성인 심장 library를 이용한 yeast two hybrid 탐색기법을 이용하였다. HOP을 과발현시킨 심장과 transfection된 10T1/2세포에서 ChIP결과 HOP/HDAC2 복합체는 protein kinase G (PKG)유전자의 3 kb upstream에 결합하였다. DNA microarray와 real time PCR결과 HOP은 calsequestrin, RNA helicase, cfos유전자를 downregulation시켰다. 10T1/2 세포와 초대배양된 흰쥐 태아 심근세포의 lysate를 GST-HOP fusion protein column을 통과시킨 결과 43, 50, 55, 120 kDa의 단백질이 검출되었다. Yeast two hybrid 스크리닝을 통하여 RAN binding protein, cardiac myosin binding protein등과 결합하였다. 이상의 성적으로부터 HOP은 PKG, RNA helicase등의 항심장비대 유전자를 억제할 뿐만 아니라 심장특이적 구조단백질등에 결합함을 알 수 있었다. 향후 in vivo조건에서 HOP과의 이들 단백질과의 상호작용의 확정 및 그 단백질들의 생물학적 의의에 대한 추가연구가 필요할 것으로 사료된다.
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